TMIS的总体结构方案设计是什么

本部分综述了同化激素类物的理化质、理与毒理学、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类物的全面了解和残留检测提供参考。

1 结构与质

同化激素类物按其结构可分为甾类同化激素和非甾类同化激素。本节所讨论的ASs包括激素和上腺皮质激素，其中残留意义较为重要的有雄激素、雌激素和糖皮质激素，雌激素又可分为雌激素和孕激素。非甾类同化激素主要是指非甾类雌激素。

1.1 ASs

ASs均含有1，2-环戊烷多氢菲基本母核（图5-71），甾核由A、B、C和D环稠合而成，其中A、B、C为6元环，D为5元环，环中常含有双键、α，β-不饱和酮或芳环，侧链为烷烃、羟基、酮基或酯等含氧基团和卤素。其中A环一般含有共轭双键，在200～400nm处有较强的UV吸收，D环C17处有侧链，C18和C19处含有甲基。ASs分子常含有羟基、酮基、双键和卤素等活基团，可以发生酰化、缩合（成肟、腙）、成醚、氧化、重氮偶合等化学反应，遇硫酸等强酸可发生橙色或荧光反应。

ASs具有相似的理化质，均呈白色或乳白色结晶粉末，弱极或中等极，难溶于水，易溶于极有机溶剂和植物油，特别是在氯仿、乙醚、二氯甲烷和乙酸乙酯等有机溶剂中有较高的溶解度，其中含酚羟基的ASs（如雌激素）溶于无机强碱溶液（pH≥12）。由于结构中有多个含氧基团，ASs具有较高的熔点（可达200～300℃）。常用的ASs及其化学结构见表5-45、表5-46、表5-47和表5-48。

1.2 非甾类同化激素

本部分讨论的非甾类同化激素主要是指非甾类雌激素，主要包括1，2-二苯乙烯类和雷索酸内酯二羟基苯甲酸类酯）类化合物。非甾类雌激素无A环芳香化合物，含有酚羟基和由碳碳双键、酮基及酚羟基组成的长共轭体系，在240～300nm处具有强的UV吸收，个别化合物亦具有荧光质。

非甾类雌激素的极和溶解与ASs相似，不溶于水，易溶于氯仿、乙醚等中等极溶剂。由于具有共轭体系，因此溶于稀碱溶液。常见的非甾类同化激素及其化学结构式见表5-49。

2 理学与毒理学

ASs具有很广泛的效应，如激素（雄激素、雌激素、孕激素）既具有维持第二征活，又具有同化作用，本部分主要讨论其同化活。ASs与非甾类雌激素具有相似的同化活，主要表现为:同化代谢；肌肉/脂肪比率增加；提高基础代谢，改善饲料转化率；抑制异化代谢作用，减少物质消耗；刺激促红细胞生成素生成，或直接作用于骨髓造血系统使红细胞生成增加；在骨骼肌细胞中已发现雄激素、雌激素和糖皮质激素受体，表明ASs可能直接作用于肌细胞导致肌肉增生。雌激素和孕激素还可通过抑制发情和避孕，增加食欲，以达到增重的目的。ASs的促生长效果对反刍动物最为显著，促进生长幅度达10%～40%，因此在养牛业中被大量应用。ASs可供注射或口服，但通常作为埋植剂使用，如以硅橡胶作为支撑材料，耳根部皮下埋植，ASs可持续释出。

同化激素类物质在细胞内具有专一受体，很小的剂量即能产生作用，故同化激素用量极小（牛的使用剂量一般仅为每头几十至数百毫克），代谢和消除速度迅速，且体内代谢产物复杂。ASs口服易吸收，吸收后与血浆中的运输蛋白结合，如激素结合球蛋白、皮质激素传递蛋白等，仅游离的ASs发挥效。在可食动物组织中，以肝、和脂肪中残留量较高，肌肉和血浆较低。孕酮在脂肪中浓度最高。肝、组织中以代谢物为主，肌肉、血浆中以原为主。

同化激素的主要毒副作用是干扰正常的激素平衡，男出现睾丸萎缩、胸部扩大、早秃和肝、功能障碍或肝肿瘤，女出现雄化、月经失调、肌肉增生、毛发增多等。长期摄入雌激素会导致女化、早熟、抑制骨骼和精子发育，特别是雌激素类物质具有明显的致癌效应，可导致女及其女后代生殖器官畸形和癌变，对于儿童则更明显。

同化激素类物质由于水溶较差，质稳定，容易在水底淤泥或土壤中富集并长期存在，故其对生态环境的影响越来越引起人们的广泛关注。ASs主要通过人及养殖场动物的排泄物进入环境，也有少部分来自工业和农业的化学污染物。ASs中的雌激素类物质是重要的环境激素污染物，包括雌激素和具有雌激素效应的物质，这些激素污染物不但影响人类健康，而且具有生态毒，容易在鱼体内浓缩，干扰鱼类正常内分泌，从而对鱼类产生毒害作用，如导致雄鱼的雌化、生殖器官畸形等。雌二醇和炔雌醇是污水中主要的雌激素物质。目前，已有报道指出约有ng/L数量级的环境雌激素存在于环境水体中，而相关研究表明，水体中1ng/L的雌二醇或炔雌醇即能诱导雄鱼体内合成卵黄红素（vitellogenin，一种存在于成熟雌鱼体内的卵黄蛋白前体）；1ng/mL的雌二醇、炔雌醇或己烯雌酚可导致雄日本青鳉两化，5～10ng/mL则完全雌化（别逆转）。

此外，一些释放到环境中的污染物能够干扰人类和动物激素调节的生理过程，改变内分泌与生殖系统的正常功能，对整个生态环境构成巨大威胁，这类化合物统称为环境内分泌干扰物。如环境中广泛存在的滴滴涕及其代谢物、十氯酮、多氯联苯、氯代二英和烷基酚类物质均具有雌激素效应。一些植物成分如三叶草中的金雀异黄素、豆科植物中的香豆雌酚亦具有一定的雌激素活。

3 国内外限量要求

目前，各国对同化激素的使用还存在一些争议，因此对同化激素的MRL要求不尽相同，其主要的争端是在以美国、加拿大为代表的国家和欧盟之间。美国和加拿大认为在养牛业中使用同化激素是安全的，并且指责欧盟的要求缺乏科学的依据。加拿大卫生部的食品安全部门批准使用天然的激素如雌二醇、孕酮、睾酮和合成激素如群勃龙在养殖业中使用，可以单独或复合的用于动物耳部的包埋；美国批准雌二醇、苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮、孕酮、群勃龙乙酸酯在动物饲养中使用。而欧盟从1988年起就禁止所有同化激素用于动物饲养，但各成员国可以授权使用睾酮、孕酮及其衍生物用于治疗目的，但也有严格的规定，必须由兽医专门注射，同时还必须登记、注册。我国于20世纪90年代起禁止将ASs用于促生长目的，农业部176公告已明确规定禁止使用己烯雌酚、炔诺酮、苯丙酸诺龙等ASs，并开始着手开展相关的监测工作。CAC、美国、欧盟、中国和日本对动物源食品中同化激素MRL的要求见表5-50。

欧盟禁止使用的同化激素清单：二苯乙烯类及其衍生物（如己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚等）；雌激素类（雌二醇、雌三醇、雌酮等）；雄激素类（睾酮、诺龙、甲基睾酮、氯睾酮、康力龙、玉米赤霉醇等）；孕激素类（甲地孕酮、甲羟孕酮、美仑孕酮等）。我国农业部规定的禁止使用的同化激素类物清单:己烯雌酚及其盐和酯、甲基睾酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇及其盐和酯；具有雌激素样作用的物质（玉米赤霉醇、群勃龙、醋酸甲羟孕酮及制剂）。

4 样品处理方法

样品前处理步骤一般包括提取、净化、衍生化等。提取过程中，根据样品基质的差异决定是否需要水解基质以释放物；由于ASs残留水平低，内源干扰物质多，对净化的效果要求较高，常见两种或两种以上萃取方法联用以达到分析要求；对于气相方法多需要衍生化，而液相分析方法则通常无须衍生化，前处理步骤相对气相方法而言较为简单。

对于多数ASs来说，较为通用的样品前处理过程如下:水解蛋白质→水解轭合物→LLE→SPE（C18、XAD、硅胶或/和IAC）→HPLC→衍生化。

ASs残留的分析样品主要包括尿液、血清（或血浆）、奶、蛋、肝脏、胆汁、脏、肌肉、脂肪、毛发、粪便、土壤、水、河床中的泥沙等。

4.1 样品的提取

由于样品质不同，提取方式相差较大。对于液体样品，需要预先进行稀释、调节pH等；半固体及固体样品需要预先与水或缓冲溶液均质后，加入碱液或缓冲溶液水解样品使共轭的物解离后，通常再用酶进一步水解以充分释放物。枯草杆菌蛋白酶、葡糖-硫酸酶和β-葡萄糖苷酸酶是ASs样品处理中常用的3种水解酶。葡糖-硫酸酶的一般水解条件为:37℃，pH5.2，2h。枯草杆菌蛋白酶一般水解条件为:60℃，pH9.5，3.5h。β-葡萄糖苷酸酶多用于液体样品的分析检测中，通常在加入酶之前需要调节适当的pH，当然，β-葡萄糖苷酸酶在某些半固体或固体样品中也有应用。ASs的硫酸轭合物通常不能被芳基硫酸酶完全水解，需进一步酸解。如将酶解样品液酸化，乙酸乙酯提取，提取液在40℃下静置1h（酸解），残余的酸用碱溶液洗涤除去。

酶解后的样品液通常在一定的pH条件下用单一有机溶剂（如乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、叔丁基甲醚、乙醚、氯仿等）或多种有机溶剂混用（如水-丙酮、氯仿-甲醇等）来进行提取，当然也有些方法直接使用C18、XAD-2（一种大孔聚苯乙烯填料）等反相SPE或IAC柱净化而省略提取步骤。

4.2 样品的净化

4.2.1 LLE

因为 ASs极较弱,所以常在甲醇、乙腈等提取液中加入弱极或中等极的萃取溶剂如乙醚、叔丁基甲醚（TBME）、氯仿、二氯甲烷和乙酸乙酯等。近年来的文献中TBME使用频率较高。

在20世纪90年代的研究中，一种被称为三相LLE系统的萃取体系被广泛用于ASs净化:用乙腈提取样品；向提取液中加入10mL正己烷-二氯甲烷（8∶2）；振荡萃取，静置后形成正己烷（上）-乙腈＋二氯甲烷（中）-水（下）三相体系；移取中间层（含ASs）浓缩后做进一步净化或测定。近年来文献中也常报道采用这种三相萃取体系，以达到净化目的。

对于某些含酚羟基的激素（如DES、己烷雌酚等）可以通过调节溶液的pH而使物在水相和有机相之间进行分配，以达到除去某些脂溶杂质的目的。此外，对于某些水溶杂质，可采用萃取前酸化或碱化样品液或萃取后用碱或酸水溶液洗涤的方法除去，这种净化方法适用于绝大多数ASs。

LLE是一种初级的净化技术，但通过多相分配体系可以较大程度地去除脂肪、蛋白质等杂质的干扰，有利于提高方法的灵敏度。

4.2.2 SPE

由于具有成本低、可操作强、易于处理高通量样品等优点，加之SPE柱的种类越来越丰富，SPE已经成为当今最为常用的样品净化手段。

常用的反相填料有 C18、C8、聚苯乙烯类型的高分子填料柱 (如HLB)；正相填料有硅胶、氧化铝、硅藻土、Florisil、Sephadex-LH-20等。反相柱主要用于富集脂溶的ASs和除去水溶或高极杂质，而正相柱多用于脱脂和除去强极杂质。在实际过程中，常将不同类型的SPE柱联合使用（正相柱、反相柱和/或IAC柱）。

4.2.3 免疫亲和萃取

利用免疫反应原理，通过制备出单克隆抗体或多克隆抗体，选择地吸附样品中的抗原物质（即目标激素）。由于抗原抗体反应的高特异、高灵敏度、高选择等特点，免疫亲和萃取无论在净化效果还是操作过程的简化方面都优于传统的SPE。但抗体的制备较为繁琐，且一般只能用于单一组分或特定类别的ASs净化。

4.2.4分子印迹技术

分子印迹是能够制备出对目标分子具有特定识别能力的聚合物材料。分子印迹聚合物又称模拟受体，制备方法比较简单，质比较稳定，可重复多次使用，是一种发展前景较好的新型仿生材料。如Jiang等制备出针对17β-ES的分子印迹聚合物，并成功应用到鱼体内17β-ES的残留检测方法中。

4.2.5 超临界流体萃取（SFE）

SFE是一种样品制备技术。超临界流体的质介于气体与液体之间，既有液体的高密度又有气体的高扩散，能够渗透到固体内部溶解被测组分。SFE具有样品加工方便快速、有机溶剂消耗极小、易于控制且可与色谱-质谱检测器联用的特点。无毒、无污染且有化学惰的二氧化碳是常用的超临界流体，它特别适用于萃取极较弱的脂溶物质，因而超临界二氧化碳对ASs有相当好的溶解。但超临界二氧化碳对弱极、脂溶物质的良好溶解也使得萃取过程中残留较多的脂溶杂质，从而干扰衍生化和测定过程。当然，作为常规SPE的一种补充手段，有文献报道在SFE萃取池尾端串联氧化铝SPE柱，萃取后再将吸附在氧化铝柱上的待测物洗脱下来进行检测分析。

4.2.6 LC分离净化技术

相对于SPE柱和免疫亲和色谱柱的净化效果，LC具有更好的选择、分辨率和重复。一般使用反相的色谱系统，在适当的时间内收集流出组分，浓缩后进行衍生化和测定。但使用缺陷为收集液中含水量高、不易浓缩。VanGinkel等曾用不同的方法（SPE、IAC）净化牛尿液中的β-NT及其代谢物α-NT。

5 检测方法

5.1 HPLC法和LC-MS法

近年来，MS检测器等高灵敏检测器的发展、普及使得HPLC技术的分离和检测能力得到显著提高，也改变了过去行业中以GC-MS作为检测ASs主要手段的局面。HPLC可直接分离ASs、无须衍生化、柱效高、载样量大，特别是在MS检测器的配合下，解决了过去难以利用HPLC同时分析多类别ASs的问题。表5-51列出的是近年来已报道的ASs残留检测的HPLC方法。

然而随着科技的不断进步及科研实践中对检测方法的灵敏度要求越来越高，普通的HPLC仪器正逐步地被LC串联一级MS（或多级MS）、UPLC串联一级MS（或多级MS）等替代。MS检测器凭借其独特的检测碎片离子的原理和更高的灵敏度成为当前科研实践中较为常见的检测手段。表5-52列出的是利用MS作为检测器的ASs残留检测方法。

5.1.1 分离系统

虽然正相柱也可获得良好的分离效果，但由于某些正相柱对物的选择较高（如二醇基柱只对雄激素和雌激素类物质有较高的选择），加之流动相中微量水分会干扰硅胶柱对ASs的保留能力，影响分析的重复，正相柱在近年来的应用越来越少。目前应用较多是反相HPLC（RP-HPLC）方法。

由于ASs具有较高的脂溶，因而其在反相柱上有很好的保留，常用的反相柱有C18 和C8柱。此外，ASs不易解离的特也使得流动相的组成较为简单，已报道的文献中多采用甲醇（或乙腈、THF）-水。在使用多级MS检测器时，为提高离子化效率，流动相中常加入少量甲酸或乙酸。

对于同类别的 ASs检测，通常恒度洗脱即可满足分离要求。Jansen等使用 C18/甲醇-水（65∶35）分离了11种ASs。Jansen等又对ASs的分离条件进行了优化，基本体系为C18/甲醇-乙腈-THF-水。Almeida等使用10%乙腈的水溶液与纯乙腈在40min内成功分离并检测了9种ASs，其中对于DES的检测限可以达到25μg/L。Tianhe等制备出针对ES的分子印迹聚合物，并从3种结构相似的化合物（ES、EST和DES）中分离检测ES，流动相为水-甲醇（30∶70，V/V），检测限达到23g/L。

但由于近年来研究方向逐步转移至多种同化激素或同化激素与某些小分子化合物（如双酚A等）的分离，因而梯度洗脱也有较多应用。马强等对不同形态的化妆品样品均以甲醇为提取溶剂进行超声提取，经Oasis HLB SPE柱富集净化，以C18色谱柱分离，以乙腈和水为流动相梯度洗脱，6min内完成了15种激素的分离及检测。图5-72为化妆品中15种激素的分离色谱图。

5.1.2 检测方法的选择

（1）紫外（UV）检测尽管ASs在紫外区（200～400nm）均有强吸收（表5-7），但多数方法选择ASs的检测波长为241nm。这是因为在200nm处基质干扰较严重，而241nm（共轭双键）下干扰少，可以满足检测要求。当然，对于某些含有特殊结构的ASs，检测波段也略有不同，如雌激素类物质（包括二苯乙烯类和雷索酸内酯类）在260～280nm处有强吸收（芳环）；TRE在350nm处吸收最强，干扰少。正是由于ASs紫外吸收的不均一，使用多波长、程序波长或PDA检测法能有效提高检测灵敏度和选择。PDA可给出待测物在200～800nm范围内的色谱-光谱三维图谱，能清晰地显示色谱峰纯度、保留时间和吸收光谱形状，比较吸收光谱的相似，因此在ASs早期报道的快速确证方面有一定价值。

（2）荧光检测和电化学检测某些ASs具有荧光质，如雌激素类物质和TRE。Verbeke等采用LC-柱后衍生化荧光检测法测定了动物组织中的DES。尽管大部分ASs遇硫酸显色或呈现荧光，但仅适用于TLC检测。孕激素和雌激素类物质含还原的α-醇酮和酚羟基结构，采用HPLC-电化学检测器（EchD）测定可获得很高的灵敏度。荧光检测和电化学检测虽然干扰小、检测限较低，但由于适用范围小，因而多应用于单一组分或较少组分的残留分析，对ASs多残留分析中应用较少。

（3）HPLC-免疫检测法（HPLC-IA）是一种将HPLC的高效分离与IA的高灵敏检测相结合的分析方法，IA作为HPLC的离线检测器。使用分部收集器将HPLC流出组分按一定时间间隔分别收集，流出液浓缩后残留物溶于缓冲液中，进行RIA或ELISA检测，绘制HPLC流出液的时间-免疫反应曲线，即免疫图谱，根据标准品的HPLC-UVD色谱图即可标出待测物的流出位置。Jansen等建立了HPLC-RIA法测定牛尿液中TRE及其代谢物。减少收集组分的时间间隔有利于获得高的分辨率，一般每分钟收集6个组分即可。在此，LC不是单纯的净化过程，HPLC-IA能够提供色谱和IA两种完全不同质的分析信息，两者相互印证可给出很好的定量和定息，避免IA假阳。利用ASs的免疫交叉反应，HPLC-IA亦能进行相关ASs（如代谢物）的多残留分析。

（4）MS检测与UV和二级阵列检测器相比，LC-MS兼有鉴定功能和灵敏度高的特点，而且LC-MS有易于操作和自动化的优点，使得ASs多残留组分分离和检测这一困扰传统HPLC法的问题迎刃而解。LC-MS综合了HPLC和MS检测器的双重优势，对于高极、热稳定差的ASs及其代谢物，不仅可以应用HPLC进行分离，而且其前处理简单易于自动化（如样品净化）、无须衍生化、直接检测轭合物或结合物；另外，MS检测器尤其是MS/MS，由于具有子离子扫描、母离子扫描、中丢失扫描、多通道反应监测等多种分析方式，使检测方法的灵敏度和检测通量都得到了极大提高，更加适用于生物样品中痕量ASs的检测分析。此外，MS较高的确证能力也给予了分析结果更为准确的可信。

George等使用LC-APCI-MS/MS确证牛尿液中的15种同化激素。样品经葡萄糖醛酸酶降解，叔丁基甲醚-正己烷（二相LLE）萃取、HLB及氨基SPE柱净化后进行LC-APCI-MS/MS测定。图5-73为部分激素的母离子和子离子质谱图。方法检测限为0.06～0.26ng/mL。

此外，George等还成功使用LC-APCI-MS/MS确证牛肌肉中的20种同化激素。图5-74为部分激素的母离子和子离子质谱图。方法检测限为0.03～0.14ng/mL。

Hauser等建立了检测尿液中23种同化激素的LC-ESI-MS/MS方法。样品经过葡糖苷酸酶水解后，经 C18SPE柱净化,再经乙酸乙酯-硫酸混合物进行溶剂分离，在叔丁基甲醚中冷冻过夜后复溶进样。图5-75是部分激素的分离色谱图。

Yang等建立了检测肌肉、牛奶和肝脏中50种同化激素的LC-ESI-MS/MS方法。样品经葡萄糖苷酸酶水解后，用甲醇提取，经石墨化碳黑（GCB）柱和氨基柱净化后进样分析。方法的检测限达到0.01～0.70μg/kg。图5-8是试验中部分激素的MRM色谱图。

相对于很多文献中多种同化激素前处理的复杂，Malone等通过对前处理及仪器条件的优化在10min中内应用LC-ESI-MS/MS法成功完成了对牛奶中16种同化激素的分离检测。样品通过乙腈-氯化钠（二相LLE）萃取，以C18吸附填料进行分散固相净化，方法快速、简单、准确，对于每种待测物的检测限均低于1μg/L。表5-53是该试验中相关的质谱条件。

5.2 气质联用分析法

20世纪70年代即有GC-MS应用于ASs分析的报道。毛细管GC和SIM检测方式的出现使GC-MS发展成为一种集高效分离、高灵敏度检测和结构鉴定于一体的分析技术，也是目前ASs残留或兴奋剂检测中普遍采用的方法之一。GC-MS在ASs残留检测中的应用见表5-54。

5.2.1 衍生化方法

ASs及其代谢产物结构中含有多个羟基或酮基等极基团、不挥发、热稳定差，因此不适用直接进行GC分析。针对ASs结构中多羟基和酮基的衍生化方法主要包括硅烷化、酰化和肟化等。

（1）硅烷化硅烷化是ASs及其代谢物使用最广泛的衍生化方式，通常指三甲基硅烷化（TMS），少数采用叔丁基二甲基（TBDMS）硅烷化。硅烷化反应主要发生于含活泼氢原子的基团，几乎所有可能引起极干扰GC分析的基团都可以采用硅烷化的方法来改，如羟基、酚羟基、可烯醇化的酮基（邻位碳上有氢原子）、氨基、羧基等。硅烷化反应可同时发生在多种基团上，对于分子中存在着不同官能团的化合物，这种衍生化方法的优点是显而易见的。

甲硅烷化是硅烷化中最常用的反应，其衍生物通常可增加母体化合物的热稳定和挥发，色谱柱和衍生化分子之间的作用削减至最低，而使待测组分峰尖锐对称。甲硅烷化试剂种类多，但ASs衍生化中最常用的是TMS试剂，如N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺（MSTFA）、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）等。这些试剂硅烷化活高，适用于位阻较大或活较低的基团。同时其挥发高，副产物呈中，多余试剂和副产物易挥发除去。

在硅烷化反应时常常加入催化剂三甲基碘硅烷（TMIS）、碘化铵（NH4I）等。除了硅烷化试剂与催化剂，为了防止衍生化试剂被氧化分解，在衍生化过程中常常还会加入还原剂，如二硫赤藓糖醇（DTE）、乙硫醇、1-丙硫醇和2-巯基乙醇等。另外，为了中和衍生化过程中产生的酸物质，有研究加入吡啶等作为酸受体。

TMIS可增强ASs酮基的烯醇化和硅烷化试剂进攻的区域选择，因此与MSTFA合用可催化TMS烯醇醚和位阻羟基TMS醚的形成。TMIS催化MSTFA硅烷化ASs的机制:在起始阶段TMIS与MSTFA反应生成季铵盐，后者与羟基或酮基反应生成TMS醚或TMS烯酮醚衍生物，生成的碘化物继而与MSTFA结构中的TMS发生亲核取代，催化剂被再生。MSTFA/TMIS能使ASs结构中所有羟基（仲醇、叔醇）和酮基（共轭或非共轭态）在温和的条件下被定量硅烷化。

Rambaud等报道了一种新的MSTFA/I2衍生化方法。I2催化MSTFA对ASs羟基和酮的硅烷化。在GC-MS分析中，除TMS衍生物通常出现的[M-CH3]＋、[M-TMSOH]等离子外，还产生[M-COCF3]＋、[M-TMSOH-CF3]＋、[M-TMSOH-N（CH3）COCF2]＋特征离子。

许多ASs分子中兼有羟基和酮基，一些反应条件如酸等能加速酮基烯酮化。为了避免ASs结构中酮基部分烯酮化影响硅烷化产物的均一，文献中常添加MSTFA/TMIS/DTE和MSTFA/NH4I/DTE，使酮基完全烯酮化，羟基和烯醇同时被MSTFA硅烷化，生成TMS醚和TMS烯醇衍生物。这种方法反应条件温和、速度快、效率高；能得到强的分子离子峰或（和）[M-CH3]＋；醇基、酮基均被硅烷化，产物分子量高、背景干扰减少；碎片较少，适于SIM筛选检测。

经过TMS衍生后，衍生化产物在质谱EI源模式下会出现丰度较高的M＋、[M-CH3]＋和[M-TMS]＋特征离子峰，这些离子碎片可以有效提高分析的灵敏度。

此外，还可选用TBDMS试剂作为衍生化试剂，如N-甲基-N-（叔丁基二甲基硅烷基）-三氟乙酰胺（MTBSTFA），其活与TMS相似，但衍生化产物分子量更高、水解稳定好、易于制备，因此GC-MS（SIM）的定量准确更高，但对位阻基团的硅烷化能力较差。

过量的硅烷化试剂易于挥发且本身就是进样溶剂，不会干扰GC-MS测定，简化操作步骤，减少待测物损失。

（2）酰化酰化是仅次于硅烷化的常用衍生化方法，其操作简单，衍生化能力较强。酰化反应主要在ASs的羟基、可烯醇化的酮基和氨基上发生反应。衍生化试剂可分为三类:酰氯、全氟代酸酐和含有活酰基的化合物（如酰基咪唑）。

ASs酰化衍生化试剂中文献报道最多的为全氟代酸酐，如TFAA和HFBA，其中HFBA最为常用。生成的全氟代衍生物含有强电负基团，在NCI-MS或ECD检测中更容易被捕获，能产生较高丰度的特征分子离子峰，提高检测的灵敏度，同时干扰少，过量的试剂和副产物易于除去。

硅烷化和酰化是ASs最常用的两种衍生化方法，一般效果良好。

（3）肟化以羟胺类物质为衍生化试剂，进行亲核加成反应，生成肟类物质。肟化反应是基于醛酮类物质与氮亲和试剂的加成反应，酮基中的碳是缺电子中心，氧是富电子中心，所以亲核试剂易于从空间阻碍小的酮基平面的上面或下面进攻酮基的碳原子。碱的胺类衍生物特别是羟胺类物质作为亲核试剂向酮基进攻，并与酮基加成生成产物，该产物进一步反应，而生成含有碳氮双键的肟化产物。常用的肟化衍生试剂有盐酸羟胺和甲氧胺盐酸盐等。文献报道中多见肟化反应与硅烷化反应联合衍生化。

（4）腙化同肟化反应一样，利用醛酮类物质与氮亲核试剂的加成反应生成腙类物质。腙是由醛或酮分子中的羰基与肼反应生成的化合物。用取代肼做衍生化试剂使含酮基的ASs生成一种腙衍生物。在腙化反应中，常用的衍生化试剂有2，4-二硝基苯肼、五氟苯肼等。但是腙化反应的产物同肟化一样会有顺反异构体出现，同时需要在强酸条件下进行等，因此应用很少。

5.2.2 分离系统

ASs经过衍生化后极降低，一般采用壁涂层（WCOT）熔融石英毛细管柱在100～300℃进行程序升温分离，相关检测色谱分离系统见表5-54。

5.2.3 检测方式

（1）GC-MS（SIM）首先采用SIM方式进行筛选检测，阳样品再进行MS全谱确证，前者主要定量，后者主要定。选择一种丰度较高的离子作为SIM特征离子，由于MS系统仅对一种或少数离子反复扫描，可以获得较总离子流（TIC）检测方式高2～3个数量级的灵敏度。为提高GC-MS定量的准确，一般取氘代同类物质做内标法定量。图5-77为GC-EI-MS（SIM）检测猪肌肉中ASs的质谱色谱图。

（2）GC-MS/MS MS/MS的能较单级MS大为提高，选择和灵敏度都有大范围提高，也更便于结构分析。但由于GC-MS/MS操作成本增加，程序复杂，而传统的GC-MS以良好的检测灵敏度、避免过多的溶剂浪费、较低的运行成本而受到痕量分析工作者的青睐，能基本满足常规的残留分析，因此GC-MS/MS在ASs残留分析中应用不如LC-MS/MS广泛。

（3）气相色谱-高分辨质谱检测法（GC-HRMS）磁式双聚焦高分辨MS分析器可与毛细管GC连接用于常规的SIM检测方式。其检测限比常规四级杆MS降低2个数量级以上，能更精确地测定物质的分子量和元素组成，是一种很有发展前途的分析方法。

（4）气相色谱-燃烧/稳定同位素丰度比-质谱检测法（GC-C/IR-MS）正常情况下动物体内或排泄物中ASs分为体内天然的内源和人工合成两种，传统检测方法如GC-MS或LC-MS等都不能予以区分，从而给残留分析增加了难度。Buisson等使用GC-C/IR-MS区分体内的内源AS和人工合成AS。其利用的原理为:动物违禁使用ASs后，其代谢产物与内在天然合成的ASs在碳同位素（13C/12C）丰度比方面存在差异。Gabor Balizs、Véronique Ferchaud等利用GC-C/IR-MS研究了不同饲喂条件、年龄、别等对ASs原型及其代谢产物的碳同位素丰度比方面的影响。GC-C/IR-MS相比传统的检测方法有其突出的优点，但所需样品量较大，应用有一定限制，通常作为一种选择方法。

6 免疫分析法

基于抗原/半抗原-抗体特异反应的免疫分析法作为一种分析手段已经渗透到残留分析的各个环节，包括提取、净化、分离和检测，如免疫亲和色谱法和ELISA。免疫分析法用于检测动物源食品中的兽残留或其他化学物质的含量，灵敏度高、特异强，具有很高的使用价值。免疫分析法由于成本低、快速、可靠、灵敏度高，目前已广泛用于兽残留的监测，如高灵敏度的ELISA已成为国内兽残留现场监控、大量样品筛查的主要方法。关于同化激素类物免疫分析法中半抗原的合成和抗体制备及常规免疫分析法的建立，李俊锁等已做了较详尽叙述，在此不再赘述。本部分主要对部分商品化的试剂盒及一些新技术在免疫分析法上的应用做简要概括。

放射免疫法（RIA）是一类采用放射元素或化合物标记的灵敏度非常高的一类免疫分析法。王传涛建立了DES的荧光免疫分析法，并对包被抗原浓度、抗体浓度、缓冲体系pH进行了优化，测定的线范围为0.1～1000ng/mL，相关系数为0.991 2，该方法用于鸡肉中DES的测定效果良好。代娟等综述了近年来应用ELISA检测动物尿样中的DEX残留等合成类糖皮质激素类残留的研究进展。

随着检测手段趋于快速化、商品化，相应兽残留检测ELISA试剂盒、试纸条等快速检测技术应运而生。试剂盒和试纸条均利用ELISA原理，可以实现饲料、动物组织、尿液中的糖皮质激素残留的半定量检测，是一种高效、快速、简便和特异好的检测或初筛方法。与常规的HPLC等仪器检测方法相比，其最突出特点是速度快，30～60min就可以完成，而仪器检测通常需花费数小时；还可节省成本，如试纸条自身成本较低，且不需要配备其他仪器仅靠肉眼就可完成现场检测。此外，免疫亲和色谱技术和分子印迹技术等还具有样品前处理简单、操作简便和便于携带等优点。多种用于筛选牛奶、尿液、组织及饲料样品中糖皮质激素（DEX、BET、FLM、TRA、PRE）的ELISA试剂盒被逐渐推向市场。此外，试纸条检测方法为定或半定量方法，其特点为操作简单，样品无须处理或仅需简单处理后即可进行检测，整个操作时间非常短，通常5～10min即可完成，但灵敏度较ELISA低，特异较差。目前已有多家公司生产的检测试剂盒上市，如德国拜耳公司、荷兰ED公司、英国Randox公司等。采用一步法操作简便，节约时间，以羊抗兔二抗包被酶标板，依次加入特异DES抗体、酶标记DES及DES标样或试样进行孵育时，特异DES抗体与固定的抗兔抗体结合，样品中的DES和酶标记DES与特异抗体连接位点上竞争结合。胡鲲等用德国拜耳公司试剂盒检测中华鳖肌肉中的DES，平均最低检测下限为0.0125ng/kg，平均回收率为74.8%。但这种一步法需要相应的酶标记小分子与之配套，且有些半抗原小分子不稳定，很难制备酶标或其他标记的复合物。

ELISA技术虽已被广泛应用，但其亦有自身的缺陷，由于抗体识别物是特异结合，即使制备广谱抗体也只能实现对同一类物的多残留检测，与真正意义上的多种物残留的同时检测还相距甚远。研究残留检测的新技术或新方法为有效监控兽残留提供可靠的技术支撑，是目前残留分析领域的重点和难点。半导体纳米晶体简称量子点，如CdTeQDots具有荧光量子产率高、抗光漂白能力强、荧光发射波长随尺寸变化可调等一系列独特的光学质，具有传统荧光染料无可比拟的优越，应用前景非常广阔。将QDots作为免疫反应中的荧光标记物是近年来荧光免疫分析中出现的一个新领域。QDots作为生物标记物已被广泛应用于细胞分离与标记、荧光探针以及活体和组织成像等研究领域。QDots的多色标记功能给多残留分析带来无限的希望与挑战，已有报道建立了基于QDots标记的磺胺类和喹诺酮类物残留的新方法，并成功应用于动物源食品中兽残留的检测。基于同一类型的量子点可以通过调整粒子尺寸大小得到不同颜色的荧光，而粒子的组成和表面质无须改变的原理，可以采用一套通用的偶联方法实现多色标记。如随CdTeQDots纳米粒子增大，QDots的颜色不断改变，在同一激发波长下发射波长亦会随之增加。目前基于QDots的多色标记技术在定检测如在组织定位、信号转导、活体标记及细胞筛选等方面已取得显著的成效。例如将QDots的多色标记功能与免疫组化技术结合实现了对细胞多种成分的同时检测，大大提高了临床病例的诊断效率。然而将量子点的应用由定分析发展到小分子物质的检测则难度增大许多。目前关于应用QDots多色标记功能进行定分析的报道较多，但相应的定量或半定量分析研究报道则非常少，特别是在物（包括兽和农）残留检测领域。Peng等以亲和素为桥，将生物素化的变BSA包被到不同荧光特的量子点上，再与识别不同物的生物素化一抗反应，成功建立了一种同时检测5种兽残留的新型荧光检测方法（图5-78）。该方法中包含了DEX和MPA2种同化激素类物，对猪肉中实际样品进行检测亦取得很好效果。

表面等离子共振（SPR）是电磁波所激发的在金属和电介质交界面上形成的影响电磁波传播的谐振波，是一种光学现象，一种消逝波。SPR现象的本质是:产生SPR现象时的光入射角称为SPR角，SPR角随金膜表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金膜表面结合的分子质量成正比（图5-79）。SPR生物传感器正是基于这一原理，将探针或配体固定于传感器芯片镀着的金膜表面，含分析物的液体流过传感片表面，分子间发生特异结合时可引起传感片表面折射率改变，通过检测SPR信号改变而监测分子间的相互作用。SPR生物传感器融合了SPR技术、表面化学技术及流体检测技术，能够实时地为生物大分子间的相互作用反应提供亲和力、特异和反应动力学等实时数据。SPR检测技术无须对检测样品进行标记，而且能够实时对分子间相互作用的过程进行分析。在SPR分析过程中，靶物质可以天然状态存在于分析物中，在自然条件下进行分析，因此保证了所得结果的真实。因此SPR技术具有实时、免标记、无须事先纯化地定量检测生物分子和监测两种或多种分子间的结合的优点。

Jiang等建立一种定量的SPR免疫分析法测定尿样中EST的含量。该方法以金纳米颗粒包被抗体增强检测信号，无须对尿样进行任何前处理，在2min内即可完成检测，检测限达0.016ng/mL。Kreuzer等利用局域SPR技术建立了一种无标记检测康力龙的免疫分析法。该检测方法可以实现nmol/L级的检测。与传统的SPR方法相比，该检测法较上述几种方法有其明显的优点:①检测时间短，20min即可分析一个样品；②操作简便；③SPR免疫分析法敏感高，准确度高。表面等离子体的光学生物传感技术整个过程无须标记抗体，便于实现实时检测，在生物大分子相互作用的研究中已经发挥重要作用，相信在未来的同化激素类物残留检测中定会发挥重要作用。

微阵列芯片即一般所谓的基因芯片，也是基因组计划完成后衍生出来的产品，花费成本虽高，但效用无限，是目前所有生物芯片中应用最广的，由于近年来不断改进，也是最有成效的生物技术。一般而言，基因芯片是利用微处理技术，先把人类所有的基因分别固着在小范围的玻璃片、薄膜或者硅芯片上；然后可以平行地、大量地、全面地侦测基因组中mRNA的量，也就是侦测基因的调控及相互作用表达。相对于基因芯片的广泛应用，基于微阵列技术实现兽残留检测的报道还不多见，针对同化激素类物检测的报道相应地更少一些。其原理是芯片上的探针与对照或样品中的目标物结合，借助不同的标记方法实现定位，经影像分析软件可将影像强度转换成数据，用以分析样品中的待测物含量（图5-80）。